生物胚胎工程

胚胎工程

• 胚胎工程的概念

  • 操作对象：动物早期胚胎或配子

  • 技术基础：

    • 体外受精

    • 胚胎移植

    • 胚胎分割

    • 胚胎干细胞培养

  • 必须程序：经过处理后获得胚胎，移植到雌性动物体内生产后代。

• 早期胚胎发育

  • 精子的发生

    • 场所：雄性动物睾丸内

    • 时期：初情期到生殖机能衰退

    • 过程：

      • 第一阶段：

        • 精原细胞有丝分裂为大量精原细胞

        • 部分精原细胞进行染色体复制和其他物质合成

        • 产生初级精母细胞

      • 第二阶段：

        • 初级精母细胞进行减数第一次分裂产生次级精母细胞

        • 次级精母细胞进行减数第二次分裂产生精子细胞

      • 第三阶段：

        • 精子细胞变形为精子：

          • 细胞核：精子头的主要部分

          • 高尔基体：头部的顶体

          • 中心体：精子的尾

          • 线粒体：线粒体鞘

          • 其他物质：原生质滴，最后脱落

  • 卵子的发生

    • 场所：雌性动物卵巢内

    • 时期：动物的胚胎在性别分化以后

    • 过程：

      • 卵原细胞有丝分裂、演变

        • 时期：胎儿期

        • 场所：卵巢

      • 初级卵母细胞形成卵泡和透明带，进行减数第一次分裂

        • 时间：排卵前后

        • 场所：卵巢

      • 次级卵母细胞和第一极体进行减数第二次分裂

        • 时间：精子和卵子结合过程中

        • 场所：输卵管

      • 成熟的卵子和第二极体

  • 受精

    • 概念：精子和卵子结合形成合子（即受精卵）的过程

    • 场所：雌性输卵管中

    • 过程：

      • 准备阶段：

        • 精子获能：在雌性动物的生殖道内完成

        • 卵子的准备：发育到 M II 中期 才有受精能力

      • 受精阶段：

        • 精子穿越放射冠（顶体反应）

        • 穿越透明带（透明带反应：阻止多精入卵受精的第一道屏障）

        • 精子入卵，进入卵细胞膜（卵细胞膜反应：阻止多精入卵受精的第二道屏障）

        • 雌、雄原核形成

        • 雌、雄原核融合（受精完成的标志）

  • 胚胎发育

    • 过程：

      • 卵裂期：受精卵到桑椹胚到囊胚

      • 囊胚到原肠胚

    • 各阶段特点：

      • 卵裂期：细胞分裂方式为有丝分裂，细胞数目不断增加，胚胎总体积不增加或略有减小。

      • 桑椹胚：细胞数目达到 32 个左右，每个细胞都是全能细胞

      • 囊胚：

        • 细胞开始分化

        • 内细胞团将来发育成胎儿的各种组织

        • 滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘

        • 随着胚胎进一步发育，出现囊胚腔

      • 原肠胚：内细胞团表层细胞形成外胚层，下方的细胞形成内胚层，出现原肠腔

• 试管动物技术

  • 概念：通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。

  • 目的：实现良种动物的快速大量繁殖。

  • 技术手段：首先要做的是体外受精和早期胚胎的培养。

• 体外受精

  • 基本步骤：卵母细胞的采集和培养、精子的采集和获能、受精。

  • 卵母细胞的采集和培养

    • 输卵管冲取法

      • 适用范围：实验动物和家畜

      • 采集过程：利用促性腺激素促使超数排卵，从输卵管内冲取卵子。

      • 采集后的操作：可直接与获能的精子在体外受精

      • 例子：小鼠、兔、家畜、猪、羊等

    • 已屠宰母畜卵巢内收集

      • 适用范围：大型动物或大家畜

      • 采集过程：从已屠宰的雌性动物体内摘取卵巢，从卵巢中采集卵母细胞。

      • 采集后的操作：卵母细胞体外人工培养成熟后，与获能的精子受精。

      • 例子：牛

    • 活体采卵

      • 适用范围：大型动物或大家畜

      • 采集过程：借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜等仪器，直接从活体动物卵巢中吸取卵母细胞。

      • 采集后的操作：卵母细胞体外人工培养成熟后，与获能的精子受精。

      • 例子：牛

  • 精子的采集和获能

    • 收集精子的方法：

      • 假阴道法：牛、马等体型大的动物

      • 手握法：猪、犬等体型较小的动物

      • 电刺激法：野生或经济动物

    • 精子体外获能的方法：

      • 培养法：

        • 操作过程：将精子放入人工配制的获能液中使其获能

        • 适用动物：兔猪等小动物

      • 化学诱导法：

        • 操作过程：将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体 A23187 溶液中，用化学药物诱导精子获能

        • 适用动物：牛羊等大动物

  • 受精：

    • 获能的精子和培养成熟的卵子，一般情况下都可以在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。

    • 受精过程：

      • 卵巢中取出卵母细胞，进行卵母细胞培养，获得 M II 期卵母细胞。

      • 新鲜或解冻的精液，进行精子离心处理、获能处理后获得精子。

      • 进行体外受精、受精卵培养。

• 人工胚胎早期培养

  • 培养液成分

    • 盐类：无机盐和有机盐

    • 营养物质：氨基酸、核苷酸

    • 调节物质维生素、激素

    • 特有物质：血清

  • 胚胎早期培养目的：精子和卵子体外受精后，应将受精卵移入发育培养基中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。

  • 胚胎去向：胚胎发育到适宜的阶段后，取出进行受体移植或冷冻保存。

  • 胚胎移植时间：不同动物胚胎移植的时间不同。牛羊一般桑椹胚或囊胚才进行移植，小鼠和家兔等实验动物更早，人的体外受精胚胎可在 8~16 细胞阶段移植。

• 胚胎移植

  • 概念

    • 移植对象：雌性动物体内的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式获得的胚胎。

    • 移植条件：同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内。

    • 供体：在胚胎移植中提供胚胎的个体。

    • 受体：在胚胎移植中接受胚胎的个体。

    • 地位：是胚胎工程其他技术的最后一道“工序”。

  • 意义：充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，大大缩短了供体本身的繁殖周期，增加供体一生繁殖后代的数量。

  • 生理学基础（成功的保障）

    • 胚胎移入的基础：哺乳动物发情排卵后，同种动物的供体、受体的生殖器官的生理变化是相同的。

    • 胚胎收集的基础：哺乳动物早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离的状态。

    • 移入胚胎存活的基础：受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应。

    • 保留遗传特性的基础：供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程中不受任何影响。

  • 基本程序

    • 供体、受体的选择和处理

      • 选择：供体遗传性能优良、受体健康。

      • 处理：对供体、受体进行同期发情处理和对供体进行超数排卵处理。

    • 配种或进行人工授精

    • 胚胎的收集、检查、去向

      • 收集：冲卵。

      • 检查：发育到桑椹胚或囊胚阶段。

      • 去向：直接向受体移植或冷冻保存（放入 -196 度的液氮中保存）

    • 胚胎移植

      • 方法：手术法和非手术法

    • 胚胎移植后的检查：检查受体母牛是否妊娠。

    • 产下犊牛。

  • 胚胎分割

    • 概念：采用机械方法将早期胚胎切割成 2/4/8 等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。

    • 实质：动物的无性繁殖或克隆。

    • 特点：后代遗传性状相同。

    • 主要仪器设备：实体显微镜和显微操作仪。

    • 操作程序：

      • 选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚，移入盛有操作液的培养皿中。

      • 用分割针或分割刀片切开胚胎，吸出其中的半个胚胎，注入预先准备好的空透明带中，或直接将裸半胚移植入受体。

      • 还可用分割针分割滋养层，做 DNA 分析性别鉴定。

    • 注意事项：对囊胚阶段胚胎分割时，一定要均分内细胞团，否则发育不均。

  • 胚胎干细胞

    • 来源：早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。

    • 简称：ES 细胞或 EK 细胞。

    • 特点：

      • 形态上：体积小、细胞核大、核仁明显。

      • 功能上：具有发育的全能性。

      • 在体外培养条件下，可以只增殖而不分化。可以冷冻保存，也可以进行遗传改造。

    • 主要用途：

      • 治疗人类的某些顽疾

      • 培育出人造组织器官，用于器官移植

      • 揭示细胞分化和细胞凋亡的机理

      • 用于对哺乳动物个体发生和发育规律的研究

判断：试管牛是在试管内完成整个胚胎发育的。
错误，桑椹胚或囊胚阶段进行受体移植或冷冻保存。

判断：体外受精培养的胚胎并非全部都适合作为移植的材料，需要进行筛选。
正确。

采集到的卵母细胞是否都能直接与获能的精子受精？为什么？
不能。
促性腺激素处理后的从输卵管中冲取的卵子可直接与获能的精子受精。
已屠宰母畜卵巢中采集的卵母细胞、活体卵巢吸取的卵母细胞还需要体外人工培养成熟后，才能受精。

精子获能处理前为什么要离心处理？
精液由精子和精浆组成，精浆中含有抑制精子获能的物质，要离心除去精浆，以便于精子获能。

• 自然受精、人工授精和体外受精的异同

• 不同点

  • 过程不同：

    • 自然受精：雌雄动物交配完成

    • 人工授精：用人工方法将公畜精液注入母畜生殖道内，完成受精

    • 体外受精：人工获取精子、卵子，在体外培养液中完成受精过程

  • 场所不同：

    • 自然受精：雌性动物输卵管中

    • 人工授精：雌性动物输卵管中

    • 体外受精：体外培养液中

• 相同点

  • 精子获能、卵子成熟后才能完成受精过程

  • 都是有性生殖

超数排卵处理的做法是给供体注射促性腺激素。

从输卵管中冲取的卵子，可直接与获能的精子在体外受精。
从卵巢获取的卵母细胞，都要在体外人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。

试管动物技术中，首先要做的是体外受精和早期胚胎的培养。

哺乳动物体外受精主要包括卵母细胞的采集和培养、精子的采集和获能、受精等几个主要步骤。

收集精子常用的方法有假阴道法、手握法、电刺激法。

精子体外获能的方法有培养法和化学诱导法。

早期胚胎发育的营养物质来自卵黄

精子获能是指精子必须在雌性动物生殖道内发生相应的生理变化后，才能获得受精能力的生理现象。

防止多精入卵受精的两道屏障：透明带反应和卵细胞膜反应。

受精的标志：卵细胞膜与透明带的间隙能观察到两个极体。

受精完成的标志：雌雄原核融合形成合子。

卵子的成熟发生在输卵管中。

受精卵的有丝分裂称为卵裂，所产生的子细胞构成的实心胚称为桑椹胚，实心胚进入子宫腔后，内部出现含有液体的囊腔叫囊胚腔，此时的胚胎称囊胚。

囊胚表面是单层扁平细胞，称滋养层细胞，将来发育成胎儿的胎膜和胎盘，在腔的一端有一团细胞，称内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织。

精子和卵子的发生都是从初情期开始的吗？
不是，精子从初情期开始，卵子从动物胚胎性别分化后开始。

初级精母细胞减数分裂后即可得到精子吗？
不是，精细胞还要进行变形产生精子。

判断卵子是否受精的重要标志是在透明带和卵细胞膜的间隙是否观察到两个极体。

顶体反应的作用：形成精子穿越放射冠和透明带的道路

分析受精卵中遗传物质的来源：
核遗传物质(染色体中的 DNA) 一半来自精子，一半来自卵子。
细胞质中的遗传物质(线粒体中的 DNA) 几乎全部来自卵子。

• 精子入卵后的反应：

• 发生卵细胞膜反应

• 精子尾部脱离，形成雄原核

• 卵子完成减数第二次分裂，排出第二极体

• 雌原核形成，雌雄原核融合

精子什么时候入卵？
精子进入卵细胞膜时入卵。

受精卵的形成依赖于生物膜的流动性。

合子形成后在输卵管中进行早期有丝分裂，然后进入子宫着床。

完成减数第二次分裂的卵细胞的染色体数目是 2N.

原肠胚发育分化形成几个胚层？
内、中、外三个胚层。

次级卵母细胞形成需要激素调节吗？
需要促性腺激素调节。

精子与卵子相遇时，发生顶体反应，释放顶体酶，溶解卵丘细胞之间的物质，形成精子穿越放射冠的道路。

精子穿越放射冠后，顶体酶将透明带溶出一条孔道，精子运动接触并进入卵细胞膜。

精子接触卵细胞膜的瞬间，产生阻止后来精子进入透明带的生理反应，称做透明带反应，是防止多精入卵受精的第一道屏障。

精子入卵后，卵细胞膜立即发生拒绝其他精子再进入卵内的生理反应，称为卵细胞膜反应，是防止多精入卵受精的第二道屏障。

精子入卵后，被激活的卵子完成减数第二次分裂，排出第二极体后形成雌原核。

囊胚时期开始出现细胞分化，原肠胚时期开始出现胚层分化。

原肠胚中，靠近原肠腔的是内胚层。

动物胚胎由合子经有丝分裂形成，合子只能由一个精子和卵子结合的生理基础是透明带反应和卵细胞膜反应。

囊胚时期含有全能细胞吗？
含有。内细胞团中有胚胎干细胞，属于全能细胞。

刚排出的卵子是成熟的卵子吗？
刚排出的卵子尚未完全成熟，
有初级卵母细胞，如马、犬等。
有次级卵母细胞，如羊、猪等。

• 精子和卵子发生的比较

• 不同点

  • 场所：

    • 精子：睾丸曲细精管

    • 卵子：卵巢(M I)、输卵管(M II)。

  • 时间：

    • 精子：初情期后

    • 卵子：性别分化后开始，卵泡的形成和在卵巢内的储备在出生前完成，减数第二次分裂在精子和卵子结合过程中完成。

  • 过程特点：

    • 精子：

      • M I 和 M II 是连续的

      • 细胞质均等分配

      • 精细胞需要变形

    • 卵子：

      • M I 和 M II 是不连续的

      • 细胞质不均等分配

      • 不需变形

  • 结果：

    • 精子：形成 4 个精子

    • 卵子：形成 1 个卵子和 3 个极体

• 相同点

  • 原始生殖细胞增殖方式为有丝分裂

  • 产生精子和卵子的方式都是减数分裂，一次染色体复制，两次细胞分裂，子细胞中染色体数目减半。

精子的形成为什么划分为三个阶段？
三个阶段对应三个不同过程。
第一阶段，精原细胞形成初级精母细胞。
第二阶段，初级精母细胞形成精细胞。
第三阶段，精细胞变形为精子。

精子变形时，为什么细胞核和线粒体会保留下来？
细胞核是精子遗传物质的主要储存场所。
线粒体是精子进行有氧呼吸产生能量的主要场所。

卵泡是如何形成的？
一个初级卵母细胞被卵泡细胞包围，形成一个卵泡。

一个卵泡能形成几个卵子？
一个卵泡中只有一个初级卵母细胞，形成一个卵子。

排卵指的是什么？
卵子从卵泡中排出。

放射冠是包围卵子透明带的卵丘细胞群。

雌原核一般略小于雄原核。

多数哺乳动物的第一极体不分裂为两个第二极体。

囊胚进一步扩大，导致透明带破裂，胚胎从中伸展出来，这个过程叫孵化。

胚胎工程技术目前在生产中应用较多的是家畜的胚胎移植和胚胎分割和体外生产胚胎技术。

目前牛的体外受精技术水平最高。

对早期胚胎进行性别鉴定的方法：DNA 分子杂交技术（利用基因探针鉴定）、分析胚胎细胞的染色体组型。

判断：胚胎移植时，可以将早期胚胎移植到不同种的雌性动物子宫内。
错误。

判断：进行胚胎移植时，对供体、受体都要进行同期发情处理和超数排卵处理。
错误，对受体无需进行超数排卵处理。

判断：转基因动物的培育不需要通过胚胎移植技术。
错误。

判断：胚胎移植时胚胎工程中最后一道“工序”，移植的胚胎一般在原肠胚之前，也可直接移植受精卵。
错误，不能直接移植受精卵。

胚胎移植的后代具有供体和受体共同的遗传性状吗？
不具有，后代的遗传性状由供体决定，受体只是提供了胚胎发育场所，不影响后代的遗传特性。

胚胎移植过程中，对供体、受体的选择有哪些要求？
供体：遗传性能和生产性能优良。
受体：有健康的体质和正常繁殖能力。

胚胎移植中两次使用激素的目的分别是什么？
第一次用激素对受体和供体进行同期发情处理。
第二次用促性腺激素对供体进行超数排卵处理。

胚胎移植中，冲卵指的是冲出卵子吗？
不是。
冲卵指将母畜子宫内的胚胎冲洗出来。

胚胎移植中，冲卵指将母畜子宫内的胚胎冲洗出来。

胚胎移植过程中需要几次检查？分别检查什么？
两次检查。
第一次是冲卵后，对胚胎进行质量检查。
第二次对受体母畜进行是否妊娠的检查。

胚胎移植中的胚胎来源有哪些？
转基因、核移植、体外受精、体内受精。

判断：在进行胚胎分割时，应选择发育良好的囊胚或原肠胚。
错误，不能选择原肠胚。

判断：胚胎分割时需要将原肠胚的内细胞团均等分割。
错误，胚胎分割不能选择原肠胚。

胚胎分割的意义：加快繁殖速度，提高胚胎利用率，是动物无性繁殖或克隆的方法之一。

在培养液中加入分化诱导因子，可以诱导 ES 细胞向不同类型的组织细胞分化。

比较全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。
全能干细胞：形成机体任何组织器官甚至整个个体的能力。
多能干细胞：有分化成多种细胞组织的潜能，但不能发育为完整个体。
专能干细胞：只能分化成某种特定类型的细胞或功能密切相关的两种类型的细胞。

判断：专能干细胞只能分化成某一种类型的细胞。
错误，可以分化成功能密切相关的两种类型的细胞。

对供体、受体进行同期发情处理，一般选用什么激素？
孕激素。

胚胎移植中，冲取胚胎的场所是？
子宫或输卵管中。

判断：分割后的胚胎具有相同的遗传物质。
正确。

ES 细胞在饲养层细胞上，是为了抑制胚胎干细胞分化。

如何抑制胚胎干细胞分化？
培养在饲养层细胞上。

科学家用显微注射技术将特殊的引导序列与“基因剪刀——Cas9酶”导入目的细胞。

从早期胚胎发育过程分析，从受精卵到原肠胚的过程中出现孵化的时期为囊胚期。

体内受精顺序

1. 1.

   卵细胞膜反应

2. 2.

   释放第二极体

3. 3.

   顶体反应

4. 4.

   穿越透明带

5. 5.

   雄雌原核形成

6. 6.

   核膜消失，雌雄原核融合

3->4->1->2->5->6

卵丘细胞组成放射冠。

判断：需配置一系列不同成分的培养液以培养不同发育时期的胚胎。
正确。

判断：胚胎分割可产生基因型完全相同的新个体。
正确。

判断：胚胎分割次数越多，产生的新个体也越多。
错误，成功率等下降。

胚胎工程的实质：在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。

卵泡形成时间？胎儿期。